（二）基因工程

基因工程是按人的意愿用分离纯化或人工合成的DNA（目的基因）在体外与载体DNA（质粒、噬菌体等）结合，成为重组DNA，以此去转化宿主（细菌或其他细胞），筛选出能表达重组DNA的活细胞（称转化子），并将其加以纯化、传代、扩增，成为克隆，以此获得大量相同的DNA分子。因此，基因工程也称为基因克隆。

所谓克隆就是同一副本或拷贝的集合，相当于无性繁殖系；获取同一拷贝的过程称克隆化。从大量群体细胞中分离出单一细胞类型，这样产生的很多相同细胞称为克隆细胞。例如从由免疫小鼠脾细胞（能产生抗体）和骨髓瘤细胞（能在体外无限制繁殖）融合成的杂交瘤细胞群体，分离筛选出分泌某一特异性抗体称为单克隆抗体。同样，从众多不同的分子群体中分离到很多相同分子即分子克隆。现代生物技术所谈的分子克隆是指DNA（分子）克隆。

基因工程的基本过程可概括为分、切、接、转、筛5个阶段。

1.分——载体和目的基因的分离

（1）载体　常用的有质粒、γ噬菌体、M13噬菌体等。

质粒是环形双链DNA，大小约为数千个碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。每个细菌能容纳的质粒数目称为拷贝数。拷贝数越大，当然对基因工程的生产应用越有利。质粒易于从一个细菌转移入另一个细菌。质粒上往往带有一个或两三个抗药性基因，这就有利于应用它的抗药性进行下一步的筛选工作。理想的质粒，对同一种限制性内切酶只有一个切口。

质粒和噬菌体在与其宿主菌共同培养中可大量产生，但它们的DNA与细菌DNA在大小、密度、碱基组成上都有差别。因此经过破碎细菌、密度梯度离心等方法，可以获得纯化的载体DNA。

（2）目的基因　可直接从染色体DNA中分离，可人工合成，也可以从mRNA合成cDNA而产生。第四种方法是组建“基因文库”，即把染色体总DNA用一种限制性内切酶随机切割成数以万计的片段，然后重组到载体中，得到数以万计的混杂质粒。然后用探针技术把目的基因“钓”取出来。

2.切——限制性内切酶的应用

限制性内切酶犹如基因工程的手术刀，它能识别核酸分子某些碱基序列并加以切开。限制性内切酶切过的DNA，有两种不同类型的切口。一种称平端切口，即在同一水平上切断DNA的两股链；另一种为粘端切口，即两链的切口错开2～4个核苷酸。

3.接——把载体和目的基因接合成体外重组体

用同一种限制性内切酶切割载体及目的基因后，无论产生的是平端切口或粘端切口，都可以用DNA连接酶把载体和目的基因连接起来。

4.转——重组体的转化

重组载体如系大肠杆菌质粒，则可在0～4℃用CaCl2处理大肠杆菌，以增大其细胞膜的通透性，然后将CaCl2处理过的细菌与重组质粒进行短暂温育，使质粒透入菌体。将DNA片段导入宿主细胞以改变其某些性状，进行转化。

重组载体如系噬菌体DNA，可进行体外包装，将其包以γ噬菌体的外壳蛋白（头部），并使其含有尾部蛋白，成为有侵染力的噬菌体，以导入宿主细胞。亦可用CaCl2处理宿主细胞，将重组DNA直接引入细胞。以噬菌体DNA导入细菌引起的转化称为转染。

进行转化和转染宜选用不含限制性内切酶的突变菌株作为宿主，以减少外源性DNA被破坏清除的可能性。

5.筛——DNA重组载体筛选与鉴定

将重组载体引入宿主细胞，并将其初步扩增后，应加以筛选，以便筛出含目的基因的菌株，并鉴定之。确定克隆株后，即可繁殖菌株进行进一步的扩增。

根据重组载体的表型进行筛选是常用方法之一。可以利用载体质粒对抗生素的抗药性进行筛选。如质粒pBR322，由4362个核苷酸对构成，对四环素及氨苄青霉素均有耐药性。将此质粒导入对上述两种抗生素无耐药性的细菌后，则此细菌变成有耐药性了。这样宿主菌是否已转化，可在培养基中加入上述抗生素予以筛选；未转化的细菌被杀死，已转化的则生成菌落。

此外，也可以利用对营养素的依赖表型来筛选。例如，目的基因是亮氨酸自养型（leu+），可把重组体转化于亮氨酸异养型（leu-）的宿主中，放在不含亮氨酸的培养液中培养。能长出菌落的，表示重组体已含目的基因，即用重组体leu+补足了宿主的leu-。而不含目的基因的质粒，却不能使leu-的宿主生长。

总之，基因重组技术发展十分迅速，具有产业化能力的基因工程正在各生物领域快速发展。基因工程可从分子水平改良现有的生物品种（如大肠杆菌），它将给生化药物、食品、轻工、化工等工业赋予新的生命力。此外，基因工程在疾病基因的发现、基因诊断（遗传病诊断）、基因治疗（利用基因工程向有基因缺陷的细胞补充相应功能的基因）和遗传病预防等方面都有广泛的应用价值。