无菌检查那些事儿
无菌检查法（Sterility tests），顾名思义就是检查是否无菌，至于检查什么，凡是药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料等均需要经过此项检查，因此它也成为制药行业绕不过去的一个话题。
认识无菌检查法
除去培养基制备、储存和稀释液、冲洗液配制等准备工作，无菌检查法实际包含3个部分的实验，分别为：培养基适用性检查、方法适用性试验和供试品的无菌检查。 培养基适用性检查：主要目的有两个，一是确认使用的培养基本身是无菌的，即无菌性检查，通过在适宜温度下放置培养基观察判定；二是确认使用的培养基细菌或真菌是可以舒舒服服生长并且在规定时间内可以被观察到，即灵敏性检查，通过接种特定菌种，观察菌生长状态判断。进行了以上实验，就可以判断检测不到细菌真菌，不是培养基自身造成的。 方法适用性试验：主要目的是判断采用的方法，薄膜过滤法或者直接接种法，是否适用于你要检测的这种产品。尤其是一些产品，本身就含有抑菌成分，这种情况下难道在整个检验期内结果呈现阴性，就是真的无菌了吗？答案是不一定的，因此我们需要排除检验过程中操作或者产品本身的抑菌性。当一个新产品进行无菌试验或者实验条件改变时，需要进行验证试验，可与供试品无菌检查同步进行。 供试品的无菌检查：这就是实打实的对于产品的无菌检测，从检测数量、检验量、阴/阳性对照、接种要求、培养观察和结果判读全都进行了细致规定。谈谈检测数量和检验量，检测数量是一批次一定数量的产品中需要抽检的数量，检验量是每瓶/支中要取多少体积的供试品用于检测。对于检测数量和检测量的规定更好更全面地评估了整批样品的无菌性。▲ 表1-无菌检查法药典包含项目或规定
1101 无菌检查法 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验需对试验环境进行监测。
培养基
硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌的培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。
培养基的制备及培养条件
培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或商品化的预制培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2～25℃、避光的环境下保存，并在经验证的保存期内使用。
1.硫乙醇酸盐流体培养基
胰酪胨 15.0g 氯化钠 2.5g
酵母浸出粉 5.0g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml
葡萄糖/无水葡萄糖 5.5g/5.0g
L-胱氨酸 0.5g 琼脂 0.75g
硫乙醇酸钠 0.5g 水 1000ml
(或硫乙醇酸) (0.3ml)
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH，使灭菌后在25℃的pH值为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层(粉红色)不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/3，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失(不超过20分钟)，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。
2. 胰酪大豆胨液体培养基
胰酪胨 17.0g 氯化钠 5.0g
大豆木瓜蛋白酶水解物 3.0g 磷酸氢二钾 2.5g
葡萄糖/无水葡萄糖 2.5g/2.3g 水 1000ml
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入葡萄糖，分装，灭菌。
胰酪大豆胨液体培养基置20～25℃培养。
3. 中和或灭活用培养基
按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌前或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。
4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基(用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查)
胨 10.0g 氯化钠 5.0g
牛肉浸出粉 3.0g 水 1000ml
葡萄糖 5.0g
除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.2±0.2，分装，灭菌。
5. 胰酪大豆胨琼脂培养基
胰酪胨 15.0g 琼脂 15.0g
大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g 水 1000ml
氯化钠 5.0g
除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入琼脂，加热溶化后，摇匀，分装，灭菌。
6. 沙氏葡萄糖液体培养基
动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g
葡萄糖 20.0g
水 1000ml
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为5.6±0.2，加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
7. 沙氏葡萄糖琼脂培养基
动物组织胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物 10.0g
琼脂 15.0g
水 1000ml
葡萄糖 40.0g
除葡萄糖、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为5.6±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
8. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)
马铃薯(去皮) 200g 琼脂 14.0g
葡萄糖 20.0g 水 1000ml
取马铃薯，切成小块，加水1000ml，煮沸20~30分钟，用6～8层纱布过滤，取滤液补水至1000ml，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为5.6±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
无菌性检查 每批培养基一般随机取不少于5支(瓶)，置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。
灵敏度检查
菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus）〔CMCC(B)26 003〕
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B)10 104〕
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)〔CMCC(B)63 501〕
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B)64 941〕
白色念珠菌(Candida albicans）〔CMCC(F)98 001〕
黑曲霉(Aspergillus niger)〔CMCC(F)98 003〕
菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养2～3天，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天或直到获得丰富的孢子，加入适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸岀孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。
菌悬液若在室温下放置，一般应在2小时内使用；若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
培养基接种 取适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照；取适宜装量的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照。接种细菌的培养管培养时间不超过3天，接种真菌的培养管培养时间不得超过5天。
结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
稀释液、冲洗液及其制备方法
稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
1. 0.1%无菌蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，必要时滤过使澄清，调节pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。
2. pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3. 56g，无水磷酸氢二钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解，必要时滤过使澄清，分装，灭菌。
根据供试品的特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为稀释液或冲洗液（如0.9%无菌氯化钠溶液）。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
方法适用性试验
进行产品无菌检查时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。
方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行方法确认。
菌种及菌液制备 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制备同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44 102〕的菌液制备同金黄色葡萄球菌。
薄膜过滤法 按供试品的无菌检查要求，取每种培养基规定接种的供试品总量，采用薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入不大于100cfu的试验菌，过滤。加培养基至滤筒内，接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的滤筒内加硫乙醇酸盐流体培养基；接种枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的滤筒内加胰酪大豆胨液体培养基。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养，培养时间不得超过5天。
直接接种法 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接入不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管按供试品的无菌检查要求，接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过5天。
结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应釆用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。
方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。
